Diego de Urbina perteneció a una amplia familia de pintores y trabajó intensamente durante un largo período, especialmente para la corte de Madrid. Desde muy temprano estuvo vinculado a este entorno y especialmente a Juana de Austria, para quien siguió pintando habitualmente a lo largo de los años. La residencia de Juana en Aranda de Duero (1549-1550) así como otras relaciones personales y familiares justifican sus vínculos con el obispo Acosta y la diócesis de Osma. Entre 1555 y 1562 Urbina trabajó intensamente en Soria y Burgos. Collar de Cáceres ha estudiado esta etapa, atribuyéndole la policromía del retablo mayor y trascoro de la catedral de Osma y del retablo del convento de Sancti Spiritus de Aranda de Duero, así como otras pinturas diversas. En 1562 regresó a Madrid.

Sobre todo se conservan obras de su última etapa (Descalzas Reales y El Escorial): obras clasicistas, de dibujo preciso, pincelada apretada y luz homogénea, muy diferentes del estilo desarrollado en su periodo anterior, que estuvo marcado por los ecos de Berruguete y Juan de Villoldo.
Esta evolución y su actividad como experto pintor de sargas merecen un capítulo aparte.